前言

近年來,過繼性T細(xì)胞(ACT)免疫治療在開拓和加速腫瘤治療領(lǐng)域方面顯示出了巨大的潛力,并在臨床實踐中取得了前所未有的突破。CRISPR-CAS9系統(tǒng)作為一種多用途的基因編輯技術(shù),為有效地創(chuàng)新腫瘤研究和腫瘤治療奠定了堅實的基礎(chǔ)。CRISPR/Cas9與腫瘤過繼性T細(xì)胞免疫治療這兩項腫瘤研究和治療革命性技術(shù)的結(jié)合,可能進一步拓寬免疫治療在更多腫瘤患者中的應(yīng)用。

CRISPR/CAS9系統(tǒng)

CRISPR/Cas9系統(tǒng)本質(zhì)上是一種針對外源DNA的細(xì)菌防御機制。CRISPR最初發(fā)現(xiàn)于20世紀(jì)80年代末,是一種由交替重復(fù)和非重復(fù)DNA序列組成的不尋常的遺傳結(jié)構(gòu)�；�因組分析表明,CRISPR和Cas蛋白作為獲得性免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用,并通過RNA引導(dǎo)的DNA切割系統(tǒng)保護原核DNA免受噬菌體和質(zhì)粒DNA的攻擊。

當(dāng)外源DNA侵入細(xì)菌時,其DNA片段作為間隔子并入CRISPR位點。然后將該位點轉(zhuǎn)錄到CRISPR前RNA(crRNA),該RNA附著到組成性形成的反式激活RNA(tracrRNA)上,由CRISPR相關(guān)蛋白修飾成gRNA。當(dāng)gRNA與非活性Cas9復(fù)合物的REC I結(jié)構(gòu)域結(jié)合時,該復(fù)合物被激活,導(dǎo)致gRNA及其互補單鏈DNA形成異源雙鏈。Cas9的HNH和RuvC核酸酶域隨后分別切割互補和非互補DNA鏈。

Cas9屬于1類CRISPR-Cas系統(tǒng)的II型,來源于化膿鏈球菌。Cas9與靶序列的偶聯(lián)需要一個原間隔基鄰近基序(PAM),一個小的入侵基因組中的3-8bp DNA序列,PAM在區(qū)分細(xì)菌自身和非自身DNA以及成功結(jié)合Cas9方面至關(guān)重要。

與ZFN和TALEN不同,ZFN和TALEN依賴于每個特定基因序列的精細(xì)蛋白質(zhì)產(chǎn)物,CRISPR/Cas9系統(tǒng)依賴于gRNAs,使其成為更靈活的平臺。Cas9蛋白保持不變,而gRNA可以方便地根據(jù)每個基因進行定制。CRISPR/Cas9系統(tǒng)的另一個優(yōu)點是,它使得在多個基因座上同時進行基因編輯成為可能,與以前的系統(tǒng)相比,它提供了一個更高效和可擴展的平臺。

CRISPR/CAS9在CAR-T治療中的應(yīng)用

目前,CAR-T細(xì)胞治療已經(jīng)在血液惡性腫瘤中顯示出前所未有的療效。然而盡管已經(jīng)取得了令人印象深刻的臨床結(jié)果,但由于多種原因,許多患者仍然無法從CAR-T細(xì)胞治療中獲益。首先,制造T細(xì)胞的個性化方法費時且昂貴,這阻礙了許多患者,尤其是疾病快速進展的患者充分利用這種免疫療法;第二,在生產(chǎn)過程中,淋巴細(xì)胞減少的患者很難產(chǎn)生足夠高質(zhì)量的T細(xì)胞,即使患者獲得足夠的免疫細(xì)胞,這些細(xì)胞也可能無法完成整個制造過程;最后,自體CAR-T產(chǎn)品的異質(zhì)性可能會導(dǎo)致不可預(yù)測和可變的臨床結(jié)果。

CRISPR/Cas9產(chǎn)生通用異基因CAR-T細(xì)胞

為了克服限制CAR-T細(xì)胞治療廣泛應(yīng)用的障礙,人們提出了多種治療策略。最可行和持久的方法之一是從健康捐贈者中產(chǎn)生異基因通用CAR-T細(xì)胞。與自體CAR-T細(xì)胞相比,“現(xiàn)成”的同種異體CAR-T細(xì)胞具有許多潛在優(yōu)勢,包括可立即為急需的患者提供冷凍保存的CAR-T細(xì)胞、首次輸注或再給藥的足夠數(shù)量以及CAR-T細(xì)胞生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化。考慮到供者T淋巴細(xì)胞上存在內(nèi)源性HLA和TCR,通用產(chǎn)品的最大挑戰(zhàn)是同種異體反應(yīng)和移植物抗宿主病(GVHD)的潛在風(fēng)險。

隨著基因編輯技術(shù)的進步,人們逐步實現(xiàn)了內(nèi)源性TCR的根除。通過鋅指核酸酶(ZFNs)和轉(zhuǎn)錄激活物樣效應(yīng)器核酸酶(TALENs),人們都制造出了敲除TCR的CAR-T細(xì)胞。然而,完全同種異體CAR-T細(xì)胞的產(chǎn)生需要同時敲除TCR和HLA分子并轉(zhuǎn)導(dǎo)CAR,這需要一種更高效和精確的基因編輯技術(shù)來實現(xiàn)。

與ZFNs和TALENs相比,CRISPR/Cas9具有良好的柔性和高效性,在異基因CAR-T細(xì)胞的制備中有著廣泛的應(yīng)用。CRISPR/Cae9可以同時高效地敲除多個基因位點。Ren等人使用CRISPR/Cas9產(chǎn)生同時敲除內(nèi)源性TCR、HLA-I和PD-1的CAR-T細(xì)胞,其在體外和動物模型中顯示出強大的抗腫瘤活性。

CRISPR/Cas9削弱抑制性檢查點分子

盡管在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中取得了顯著的成功,但由于免疫抑制性腫瘤微環(huán)境和T細(xì)胞衰竭,仍有許多患者的CAR-T細(xì)胞治療不理想。由于共抑制分子(如PD-1、CTLA-4、LAG-3和TIM-3)在T細(xì)胞功能障礙中的重要作用,CRISPR/Cas9也被用于破壞這些抑制基因以增強CAR-T細(xì)胞功能。

CRISPR/Cas9促進T細(xì)胞細(xì)胞因子的產(chǎn)生

細(xì)胞因子在調(diào)節(jié)T細(xì)胞的功能中是必不可少的。TCR刺激的強度極大地影響細(xì)胞因子的分泌。結(jié)構(gòu)性表達IL-12和IL-15的CAR-T細(xì)胞可以提高抗腫瘤活性和長期持久性。此外,已證明IL-18可促進IFN-γ的產(chǎn)生和CAR-T細(xì)胞增殖。因此,可以利用病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)人工誘導(dǎo)細(xì)胞因子的產(chǎn)生;然而,細(xì)胞因子過度表達可能導(dǎo)致T細(xì)胞耗竭或自身免疫。CRISPR/Cas9也可用于在特定位點敲入所需的細(xì)胞因子基因,并使其分泌受到內(nèi)在啟動子的嚴(yán)格控制。

二酰甘油激酶(DGK)是下調(diào)二酰甘油(DAG)的酶,DAG是下游TCR激活形成的第二信使,DGK的缺失可增強T細(xì)胞活性。研究證明了DGKA/DGKB-DKO抗EGFRvIII CAR-T細(xì)胞如何增加IFN-γ/IL-2的產(chǎn)生和體外細(xì)胞毒性以及誘導(dǎo)對TGF-β和前列腺素E2的抵抗。在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤異種移植小鼠模型中,這些CAR-T細(xì)胞在腫瘤消退方面也產(chǎn)生了有希望的結(jié)果。

CRISPR/CAS9在TCR-T細(xì)胞治療中的應(yīng)用

眾所周知,CAR-T細(xì)胞在實體瘤中的作用有限。腫瘤特異性抗原缺乏、腫瘤抗原異質(zhì)性和腫瘤微環(huán)境抑制是其主要原因。與CAR-T免疫療法相比,工程化TCR-T細(xì)胞療法在靶向更廣泛的抗原方面具有更大的前景,從而擴大了治療癌癥的范圍。

然而, TCR-T細(xì)胞治療的主要問題之一是受體T細(xì)胞上存在內(nèi)源性TCR。內(nèi)源性TCRs與轉(zhuǎn)基因TCRs競爭CD3的結(jié)合,此外,內(nèi)源性TCR與轉(zhuǎn)基因TCR的錯配也可能導(dǎo)致混合TCR二聚體的形成。

為了解決這些問題,CRISPR/Cas9系統(tǒng)被用來把內(nèi)源性TCR α和β 基因替換成具有人工腫瘤特異性TCR序列的基因。與傳統(tǒng)的TCR-T細(xì)胞相比,敲除內(nèi)源性TCR可提高轉(zhuǎn)基因TCR的表達和功能。此外,動物模型中CRISPR/Cas9修飾T細(xì)胞的抗腫瘤反應(yīng)增強。

為了減少錯誤配對的風(fēng)險,另一個策略是替換成一個穩(wěn)定的Vα/Vβ 單鏈TCR(Sc TCR)。據(jù)報道,通過CRISPR/Cas9轉(zhuǎn)導(dǎo)Sc-TCRs幾乎完全消除了TCR錯配。2020年,CRISPR/Cas9編輯的TCR-T細(xì)胞首次在難治性癌癥患者中進行了臨床試驗,對安全性和可行性進行評估。通過分離患者自體T細(xì)胞,慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)表達NY-ESO-1和LAGE-1特異性TCR,然后用CRISPR/Cas9破壞內(nèi)源性TCRs和PD-1基因。CRISPR修飾的T細(xì)胞在體外擴增后回輸3例患者。兩名患者病情穩(wěn)定,另一名患者病情進展。

CRISPR/CAS9在ACT治療中的臨床現(xiàn)狀

在過去的十年中,許多臨床試驗已經(jīng)啟動,以評估ZFNs、TALENs和CRISPR基因編輯平臺在多種疾病中的可行性、安全性和有效性,如β-地中海貧血、艾滋病、血友病B、粘多糖病(MPS)、鐮狀細(xì)胞貧血和多種惡性腫瘤。

ACT治療癌癥是最近基因編輯試驗的主要焦點之一。中國人民解放軍總醫(yī)院的研究人員于2016年開始了第一次CRISPR人類I期臨床試驗(NCT02793856),該試驗在IV期轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌患者中評估PD-1-KO原代T細(xì)胞的安全性和療效。但該研究顯示出較低的非靶向效應(yīng),并且沒有嚴(yán)重的治療相關(guān)副作用,然而,這項研究的有效性并不明確,因為沒有對治療的臨床療效進行調(diào)查。同年,開始了另外三項I期臨床試驗,評估IV期膀胱癌(NCT02863913)、轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌(NCT02867332)和激素難治性前列腺癌(NCT02867345)中的PD-1-KO原代T細(xì)胞,但所有這些試驗后來都被撤回。

TIL和原代T細(xì)胞僅構(gòu)成CRISPR介導(dǎo)的ACT試驗的一小部分,大多數(shù)臨床試驗集中于CAR-T/TCR-T細(xì)胞。在一項開放性I期研究(NCT03398967)中,評估了CRISPR/Cas9工程化通用CD19/CD22 CAR-T細(xì)胞在6例復(fù)發(fā)/難治性急性淋巴細(xì)胞白血病患者中的安全性和有效性。研究顯示,沒有GVHD或基因編輯相關(guān)的不良反應(yīng),然而,所有患者均出現(xiàn)CRS。該療法還顯示出顯著的抗腫瘤活性,83%的患者在輸注28天后達到完全緩解。

此外,關(guān)于T細(xì)胞惡性腫瘤,基因編輯可用于消除CD7的表達,這種有吸引力的標(biāo)記物在T細(xì)胞腫瘤中高度表達。Cooper等人設(shè)計了功能性UCART7,以在體外/體內(nèi)消除T-ALL,同時避免GVHD風(fēng)險;這已成為當(dāng)前針對T細(xì)胞白血病或淋巴瘤患者的臨床試驗的基礎(chǔ)(NCT03690011)。

削弱免疫檢查點的CRISPR/Cas9也正在臨床試驗中進行研究。如通過CRISPR/Cas9破壞PD-1以產(chǎn)生間皮素導(dǎo)向的CAR-T細(xì)胞(NCT03747965)和UCART(NCT03545815)進行試驗中。最近的一項臨床試驗正在研究在CD19-CAR-T細(xì)胞中使用經(jīng)編輯的內(nèi)源性造血祖細(xì)胞激酶1(HPK1)的療效;HPK1是一種負(fù)性調(diào)節(jié)TCR激活信號的激酶,因此是一種新的免疫治療靶點。

CRISPR/CAS9在ACT治療中的挑戰(zhàn)和局限性

盡管CRISPR/Cas9在提高免疫治療效果方面顯示出巨大的潛力,但與安全性和有效性相關(guān)的一些問題阻礙了其向臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化。

首先,以ACT為基礎(chǔ)的腫瘤免疫治療,包括CAR-T細(xì)胞、TCR-T細(xì)胞和TILs治療,其臨床療效依賴于足夠的T細(xì)胞。然而,大多數(shù)用于臨床試驗的CRISPR工程化T細(xì)胞通過電穿孔進行轉(zhuǎn)導(dǎo),這可能導(dǎo)致細(xì)胞損傷并阻礙T細(xì)胞體外增殖。因此,病毒載體等更安全、更高效的傳遞途徑亟待探索。

此外,cas9蛋白的免疫原性可能是限制CRISPR/cas9臨床轉(zhuǎn)化的另一個挑戰(zhàn)。78%和58%的捐贈者中檢測到抗SaCas9和抗SpCas9抗體,這表明人對Cas9蛋白具有預(yù)先存在的適應(yīng)性免疫應(yīng)答,在CRISPR/Cas9治療患者時可能引起不良反應(yīng)。

第二,盡管已經(jīng)報道了各種方法來改進gRNA設(shè)計,并增加了Cas酶的特異性,然而由于非特異性而導(dǎo)致的靶外效應(yīng)風(fēng)險仍然是將CRISPR/Cas9臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化的主要障礙。雖然目前在臨床試驗中,沒有明顯的或只有少量的脫靶位點、染色體重排或缺失,但仍需要更多患者的經(jīng)驗和更長時間的隨訪來進一步驗證其安全性和可行性。

小結(jié)

CRISPR/Cas9是新世紀(jì)最重要的發(fā)現(xiàn)之一,它將徹底改變世界,治療和消除疾病只是其前景之一。得益于CRISPR,基因治療正在迅速發(fā)展。ACT在對抗癌癥方面是一種革命性的方法,然而自推出以來,它一直面臨著許多障礙,如對實體瘤療效有限、T細(xì)胞耗竭和功能喪失、異基因T細(xì)胞相關(guān)GVHD和制造成本等。

多功能的CRISPR平臺雖然并非完美,但有潛力克服ACT面臨的這些障礙。通過利用CRISPR技術(shù)消除MHC和內(nèi)源性TCR表達,與異基因T細(xì)胞治療相關(guān)的潛在GVHD被最小化;CRISPR還可用于優(yōu)化T細(xì)胞功能,并通過破壞免疫檢查點蛋白減少耗竭;將更有效的治療性T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為更低的細(xì)胞劑量、更低的毒性和更低的成本。雖然多數(shù)臨床試驗仍處于早期階段,但隨著越來越多的臨床試驗的開展,并且一些試驗的初步結(jié)果已經(jīng)證明了可行性和有效性,CRISPR/Cas9輔助ACT癌癥治療的前景值得期待。

參考文獻:

1．CRISPR/Cas9 revitalizes adoptive T-celltherapy for cancer immunotherapy． J Exp Clin Cancer Res． 2021; 40: 269．

2． CRISPR/Cas9 Gene-Editing in Cancer Immunotherapy: Promoting the Present Revolution in Cancer Therapy and ExploringMore． Front Cell Dev Biol． 2021; 9: 674467．