前言

肝細胞癌是全球第六大最常見的惡性腫瘤，在2020年導致數(shù)十萬人死亡，然而，目前晚期肝細胞癌患者的治療選擇仍然有限。腫瘤免疫治療近年來發(fā)展迅速，尤其是在免疫檢查點抑制劑（ICI）領域，這些藥物旨在激活和增強抗腫瘤免疫，為晚期癌癥患者的治療提供了新的前景，包括肝癌。

目前，atezolizumab（抗PD－L1阻斷劑）聯(lián)合bevacizumab（VEGF抗體）在肝癌患者展示出令人鼓舞的臨床結果。盡管如此，目前只有一小部分肝癌患者受益于ICI治療，免疫相關不良事件（IRAE）的發(fā)生率也是一個重要問題，這突出表明需要更好地了解ICI與腫瘤的相互作用，以及識別免疫治療反應的預測性生物標記物。

PD－L1

PD－L1在腫瘤細胞、抗原提呈細胞和其他免疫細胞表面廣泛表達。據(jù)報道，PD－L1在HCC中的表達普遍較低（約占腫瘤細胞的10％），并且與復發(fā)和更短的OS相關。

已經發(fā)表了一些臨床試驗結果，其中PD－L1被評估為ICI反應的預測性生物標志物。在CheckMate 459 III期臨床試驗中，盡管nivolumab并未引起OS的顯著改善，但PD－L1陽性腫瘤患者對nivolumab的反應優(yōu)于索拉非尼。然而，PD－L1的預測價值尚不清楚，在CheckMate 040和NCT02658019試驗中，無論PD－L1表達水平如何，所有患者的應答率都是令人失望的。即便如此，對CheckMate 040試驗中患者的進一步分析表明，腫瘤PD－L1表達與OS的改善有關。

這些臨床試驗的矛盾結果可能部分是由于PD－L1水平檢測的局限性，包括缺乏評估PD－L1表達及其時空異質性的標準方法，以及缺乏允許確定“過度表達”的標準閾值。有兩種方法用于定義PD－L1陽性表達，即PD－L1陽性腫瘤細胞的比率，即所謂的腫瘤比例評分（TPS），以及PD－L1染色的腫瘤和免疫細胞的比率，即所謂的聯(lián)合陽性評分（CPS）。KEYNOTE－224 II期試驗使用兩種評分方法對PD－L1進行了評估，CPS被證明是更適用的生物標記物。此外，PD－L1表達的預測值可能被低估，因為它通常在單個時間點進行評估，而PD－L1表達可能是動態(tài)和可誘導的。

腫瘤突變負荷／微衛(wèi)星不穩(wěn)定性

腫瘤突變負荷（TMB）是指單個腫瘤基因組中發(fā)現(xiàn)的非同義突變的數(shù)量，包括DNA損傷反應基因和編碼DNA聚合酶＆epsilon；（POLE）和＆delta；（POLD）催化亞單位的基因改變，并已評估其作為多種腫瘤類型的生物標記物的潛力。

一項研究評估了755例HCC患者ICI反應的基因組生物標記物的頻率，發(fā)現(xiàn)TMB中位數(shù)為4個突變／Mb，只有6例腫瘤（0．8％）發(fā)現(xiàn)高TMB。此外，在一個小樣本病例（N＝17）中，TMB與ICI反應無相關性。然而，與PD－L1表達的情況一樣，TMB測定缺乏標準化閾值，量化方法也存在差異。因此，應謹慎解釋TMB的臨床價值。

DNA錯配修復（MMR）是維持基因組完整性和穩(wěn)定性的關鍵機制。MMR活性的缺乏導致稱為微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）的超突變表型。一項研究評估了pembrolizumab單藥治療86例晚期MMR缺陷型癌癥患者的療效，ORR和完全緩解率（CR）分別為53％和21％，本研究結果支持MSI可作為實體瘤對PD－1阻斷的臨床反應的預測因子。雖然MSI被認為是選擇ICI治療應答者的一個指標，但仍然缺乏HCC患者的數(shù)據(jù)。Ang等人評估了542例HCC標本的MSI，發(fā)現(xiàn)只有一例（0．2％）高MSI和高TMB，而其他幾項研究報告中，HCC中MSI的比率也普遍較低。這些發(fā)現(xiàn)強調MSI可能不是預測HCC患者ICIs反應的理想生物標志物。

腫瘤浸潤淋巴細胞

由于TME內的T細胞浸潤是免疫檢查點阻斷的先決條件，基線腫瘤內T細胞密度和表型已被廣泛研究。CheckMate 040試驗中進行的回顧性生物標記物分析表明，盡管無統(tǒng)計學意義，但經nivolumab治療的HCC患者中CD3＋或CD8＋腫瘤浸潤性T細胞數(shù)量的增加與OS改善趨勢相關。該研究進一步表明，CD3＋T細胞頻率的增加與最佳總體反應之間存在關聯(lián)。

TIL和ICI治療反應之間的聯(lián)系也在其他免疫細胞類型中進行了研究。Ng等人分析了49例ICIs治療患者的HCC樣本，并報告腫瘤內高CD38＋CD68＋巨噬細胞的患者與低CD38＋CD68＋巨噬細胞的患者相比有更好的中位OS（34．43對9．66個月），可能是因為CD38hi巨噬細胞產生更多的IFN－＆gamma；以及相關的細胞因子。

對從6例HCC患者的外周血、腫瘤組織和鄰近正常組織中分離的5063個T細胞進行深層單細胞RNA測序。結果表明，特定亞群，如耗竭的CD8＋T細胞和調節(jié)性T細胞（Treg），在HCC中優(yōu)先富集。

盡管關注TME中的淋巴細胞很重要，但將其作為生物標志物應用于臨床仍然很遙遠。如何選擇具有特定特征的淋巴細胞，如何確定陽性標準是許多尚未回答的問題之一。聯(lián)合評估多個免疫細胞的數(shù)量和PD－L1的表達以制定TME評分可能是答案之一。

特異性基因改變

近年來，與NGS的出現(xiàn)相關的分子圖譜提供了關于可操作靶點的信息，并確定了與ICIs反應相關的特定基因改變。

導致WNT／＆beta；－連環(huán)蛋白信號通路激活的CTNNB1基因突變是免疫排斥型HCC（冷腫瘤）的特征，并且與幾種免疫特征的富集分數(shù)顯著降低相關。與WNT野生型HCC相比，在31名接受不同ICI治療的亞組患者中，WNT／＆beta；－連環(huán)蛋白通路的激活改變與較低的疾病控制率（0％對53％）、較短的中位PFS（2．0對7．4個月）和較短的中位OS（9．1對15．2個月）相關。

此外，TP53基因改變是HCC患者中最常見的突變，并且與CTNNB1突變相互排斥。研究表明，TP53的改變與肝癌的免疫微環(huán)境密切相關，CD8＋T細胞浸潤較少，F(xiàn)OXP3＋Treg浸潤較多，導致免疫反應下調。

最近的研究表明，免疫相關長非編碼RNA（lncRNAs）可以預測肝癌的ICI治療反應。Peng等人報道，lncRNA MIR155的宿主基因與肝癌組織中CTLA－4和PD－L1的表達呈強正相關，并對ICI治療的療效具有預測價值。此外，Zhang等人發(fā)現(xiàn)了一種與較差生存率相關的免疫相關的lncRNA標記，是肝癌患者的獨立預后生物標志物。

一些研究表明，癌細胞固有的表觀遺傳學改變與癌變和腫瘤進展以及TME的變化有關，表明其作為免疫治療預測因子的潛力。此外，鑒于DNA甲基化可以在液體活組織檢查中測量，表觀遺傳學生物標記物可能提供額外的優(yōu)勢。

這些觀察結果表明，存在特定的基因突變，特別是與CTNNB1、TP53、非編碼RNA和甲基化相關的基因突變，可能通過與免疫微環(huán)境相互作用影響對ICI治療的反應。盡管這些研究仍處于初步階段，但這些改變可能代表肝癌患者選擇的新生物標志物。

免疫相關基因標記

最近對腫瘤轉錄組分析數(shù)據(jù)進行了綜合分析，以表征免疫微環(huán)境對ICI治療的反應性。Ayers等人確定了18基因的T細胞炎癥表達譜和6基因的IFN－＆gamma；標記，可預測多種實體瘤對pembrolizumab治療的反應。

CheckMate 040試驗結果的回顧性分析還包括對4基因炎癥信號（PD－L1、CD8A、LAG3和STAT1）的預測價值的評估。在劑量遞增和劑量擴展階段，發(fā)現(xiàn)該特征與改善的應答和與nivolumab治療相關的OS相關。最近，一個5基因免疫相關標記（LDHA、PPAT、BFSP1、NR0B1和PFKFB4）被確定并用于建立肝癌治療反應的預后模型，該模型可以對免疫治療敏感的患者進行分層。雖然這些免疫相關基因標記顯示出預測ICI反應的潛力，但這些特征還需要進一步的臨床應用測試。

外周血生物標志物

ICI治療患者腫瘤樣本的持續(xù)可用性對于生物標記物研究至關重要，然而，由于活檢的侵入性，這很難實現(xiàn)。相比之下，循環(huán)生物標志物在治療后可以很容易地收集和重復測量，使其更便于臨床使用。

研究表明，TGF－＆beta；在TME內的免疫抑制和腫瘤免疫逃避中起著核心作用。在HCC中，TGF－＆beta；信號與耗竭的免疫信號之間存在強烈的相關性。在一項II期試驗中，對29例接受pembrolizumab治療的不可切除肝癌患者的幾種代表性循環(huán)生物標志物進行了分析，結果表明，基線血漿TGF－＆beta；水平＜200 pg／mL是更好的OS和PFS的有效預測因子。

一些可溶性免疫檢查點相關蛋白最近被證明在各種癌癥類型中具有很好的預測價值。如PD－L1的外泌體，在一項研究中，循環(huán)外泌體PD－L1水平的增加幅度可以區(qū)分臨床應答者和無應答者。此外，可溶性PD－L1（sPD－L1）與NSCLC患者的免疫治療反應相關，而關于HCC患者缺乏相關數(shù)據(jù)，需要進一步研究。

外周血中的循環(huán)免疫細胞已被廣泛評估為預測性生物標記物。在tremelimumab對HCC患者與局部區(qū)域治療的聯(lián)合試驗中，發(fā)現(xiàn)在基線檢查時，外周血單個核細胞中CD4＋PD－1＋細胞的頻率在對治療有反應的患者中高于無反應的患者。此外，在16例接受nivolumab治療的肝癌患者中，觀察到基線水平較低的外周血PD－1＋B細胞陽性和PD－L1＋單核細胞陽性與疾病控制相關。

循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）可以預測幾種腫瘤對ICI治療的反應。然而，一項使用ctDNA分析晚期HCC突變情況的研究報告，WNT通路相關突變與ICI治療后的臨床結果無關，表明需要進一步研究以確定ctDNA是否確實可以作為HCC的預測性生物標記物。

高甲胎蛋白（AFP）水平被認為是肝癌患者臨床預后不良的一個預后標志物。最近，據(jù)報道，治療后血清AFP水平下降與晚期HCC更好的ICI治療效果有關。然而，checkmate040臨床試驗的結果表明，盡管基線AFP＜400＆micro；g／L比AFP＆ge；400＆micro；g／L與更長的OS相關，但無論基線AFP水平如何，ORR和DCR相似。鑒于AFP水平與患者的基線特征密切相關，應謹慎解釋其預測效果。

外周血中的生物標記物具有低侵入性的巨大優(yōu)勢，同時大量研究也顯示了其作為免疫治療效果預測因子的潛力。然而，仍然缺乏來自大樣本臨床試驗的支持性數(shù)據(jù)。此外，目前還沒有證據(jù)表明，對于任何給定的生物標記物，血液樣本的預測準確性優(yōu)于組織樣本。

腸道微生物

越來越多的證據(jù)表明，腸道微生物群在先天性和適應性免疫的發(fā)展和調節(jié)中起著至關重要的作用，研究發(fā)現(xiàn)，腸道微生物群與ICI治療反應之間似乎存在一定的關系。

Zheng等人最近通過宏基因組測序報告了肝癌抗PD－1免疫治療期間腸道微生物組組成的動態(tài)變化。他們觀察到，與無應答者相比，免疫治療應答者的糞便樣本顯示出更高的分類豐富度和更多的基因計數(shù)，反應組的微生物組成保持相對穩(wěn)定，而無反應組的變形菌數(shù)量從第3周開始顯著增加，并在第12周占優(yōu)勢。此外，據(jù)報道，ICI治療開始時使用抗生素與更差的結果相關，表明腸道微生物群對HCC治療的影響。目前正在進行一項臨床試驗（NCT03785210），以評估聯(lián)合抗生素（萬古霉素）和ICI療法的療效。

IRAE的潛在生物標志物

大多數(shù)研究集中于識別預測免疫治療療效的生物標記物，而研究與IRAE相關的生物標記物的研究相對較少。此外，大部分研究結果來自黑色素瘤患者。然而，這些研究可以作為識別預測HCC中IRAE的生物標志物的參考。

在接受ipilimumab治療的患者中，基線血清IL－6和IL－17水平與嚴重毒性風險增加顯著相關，其中IL－17與嚴重腹瀉／結腸炎相關。一項涉及167名實體瘤成年患者的回顧性研究表明，在接受nivolumab或pembrolizumab治療的患者中，基線淋巴細胞計數(shù)增加與IRAE風險增加相關。

未來的研究應該探索與ICI療效相關的潛在生物學機制，同時如何平衡IRAE的發(fā)病率和免疫治療反應也值得認真考慮。

小結

在HCC中，雖然已經進行了幾項研究以確定預測性生物標記物，但HCC相關免疫治療仍處于起步階段，探索免疫治療生物標記物預測療效的基礎研究和臨床試驗仍然有限，目前尚不可能確定哪些生物標記物可以有效預測免疫治療的療效。

特別值得注意的是，生物標志物在患者群體中經歷動態(tài)變化。因此，在治療前和治療期間從患者身上獲取樣本以評估這些動態(tài)變化并正確確定評估生物標志物的預測價值至關重要，同時應充分考慮其在臨床實踐中的應用。NGS、單細胞RNA測序和人工智能等研究技術的發(fā)展將使我們更全面地了解TME的各種成分及其相互作用，并且可以在基因組尺度上廣泛篩選潛在的生物標記物，以確定治療效果的預測因子。

參考文獻：

1．Biomarkers and Future Perspectives forHepatocellular Carcinoma Immunotherapy． Front Oncol． 2021； 11： 716844．

原文標題 ： 肝細胞癌免疫治療的生物標志物