前言

RAF激酶家族是促腫瘤有絲分裂原活化蛋白激酶途徑的關(guān)鍵激活劑。RAF激酶家族中的絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶（ARAF、BRAF和CRAF）通過(guò)絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）途徑向下游傳遞信號(hào)，以調(diào)節(jié)參與控制各種細(xì)胞機(jī)制的基因轉(zhuǎn)錄。RAF蛋白，特別是BRAF和CRAF的過(guò)度激活，在許多類(lèi)型的癌癥中驅(qū)動(dòng)腫瘤進(jìn)展和耐藥性。

BRAF突變導(dǎo)致組成型激酶激活，可在多種癌癥中檢測(cè)到，最顯著的是甲狀腺癌、黑色素瘤和結(jié)直腸癌。目前，有許多獲批的針對(duì)BRAF突變腫瘤的BRAF靶向療法，通常與MEK抑制劑聯(lián)合使用，以最大限度地抑制MAPK通路并延緩耐藥性。此外，KRAS抑制劑的發(fā)現(xiàn)和批準(zhǔn)，也在臨床試驗(yàn)中顯示了極具前景的結(jié)果。

然而，盡管已經(jīng)有了BRAF V600和KRASG12C突變癌癥的治療策略，但仍有許多MAPK活化癌癥患者沒(méi)有明確的靶向治療策略。最近，人們?cè)絹?lái)越關(guān)注癌癥中的RAF1的突變，其編碼CRAF。在MAPK通路改變的腫瘤中，CRAF正在成為對(duì)MAPK靶向治療耐藥的關(guān)鍵分子。隨著下一代測(cè)序在臨床上的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，致癌的RAF1改變?cè)诨颊吣[瘤中越來(lái)越多地被發(fā)現(xiàn)，專(zhuān)門(mén)針對(duì)這類(lèi)致癌突變的藥物正在出現(xiàn)，有望在臨床上得到應(yīng)用。

CRAF的結(jié)構(gòu)和活化

CRAF是一種75kDa的蛋白激酶，在哺乳動(dòng)物組織中廣泛表達(dá)。RAF蛋白家族共有三個(gè)保守區(qū)：CR1、CR2和CR3。CR1包含RAS結(jié)合結(jié)構(gòu)域（RBD）和富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域（CRD），它們結(jié)合RAS。CR2結(jié)構(gòu)域包含14-3-3蛋白相互作用結(jié)構(gòu)域和一個(gè)重要的抑制性磷酸化位點(diǎn)（S259），該位點(diǎn)將CRAF維持在自動(dòng)抑制狀態(tài)。CR1和CR2位于CRAF的N-末端調(diào)控區(qū)。C末端CR3包含激酶結(jié)構(gòu)域和14-3-3的額外結(jié)合位點(diǎn)（S621）。CR3中含有幾個(gè)激活磷酸化位點(diǎn)，并被不同的激酶靶向以激活CRAF。

CRAF激酶活性的調(diào)節(jié)是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及幾種蛋白-蛋白相互作用及其細(xì)胞定位和磷酸化狀態(tài)的變化。在失活狀態(tài)下，CRAF在細(xì)胞質(zhì)中以單體、自動(dòng)抑制狀態(tài)存在。抑制狀態(tài)由CRAF上的幾個(gè)抑制性磷酸化位點(diǎn)維持：S43的磷酸化通過(guò)空間位阻阻斷CRAF與RAS的結(jié)合，S233和S259的磷酸化將蛋白復(fù)合物14-3-3募集到CR2，阻止CRAF與質(zhì)膜的結(jié)合。

在有絲分裂信號(hào)的下游，當(dāng)RAS被激活時(shí)，它觸發(fā)CRAF向質(zhì)膜的募集，隨后激活。RAS對(duì)RBD具有高親和力，但CRAF激活需要RAS與CRD的額外相互作用。此外，CRD與質(zhì)膜中的磷脂相互作用，有助于從抑制狀態(tài)釋放，并穩(wěn)定與RAS的相互作用。在這個(gè)過(guò)程中，RAS從pS259置換14-3-3，使其可接近蛋白磷酸酶1（PP1）和/或蛋白磷酸酶2A（PP2A），介導(dǎo)其去磷酸化。RAS結(jié)合還誘導(dǎo)CRAF的構(gòu)象變化，釋放N-端和C-端結(jié)構(gòu)域之間的內(nèi)部自抑制相互作用，促進(jìn)CRAF的“開(kāi)放”構(gòu)象，并通過(guò)多種激酶促進(jìn)C-端催化結(jié)構(gòu)域中激活位點(diǎn)的磷酸化，包括S338、Y341、T491和S494。此外，CRAF活化還涉及二聚化。目前的證據(jù)表明，野生型RAF蛋白需要RAS和募集到質(zhì)膜進(jìn)行二聚化，一些致癌BRAF突變體在細(xì)胞質(zhì)中以RAS獨(dú)立和組成的方式與CRAF異二聚化。

CRAF的致癌作用

RAF1已被表征為人類(lèi)致癌基因，CRAF蛋白的過(guò)度激活是上游信號(hào)蛋白（如RAS和生長(zhǎng)因子受體）致癌激活腫瘤的常見(jiàn)特征。

CRAF的典型致癌作用是由MAPK通路信號(hào)傳導(dǎo)介導(dǎo)的，這通常與其激酶活性和激活周期有關(guān)。許多研究已經(jīng)證明CRAF在多種癌癥背景下調(diào)節(jié)ERK磷酸化的能力。在這些情況下，CRAF最終通過(guò)下游激活pERK的許多促腫瘤靶點(diǎn)來(lái)促進(jìn)癌癥的發(fā)生和發(fā)展。除了這種典型途徑外，CRAF還可以以不涉及其激酶活性的MAPK獨(dú)立方式促進(jìn)癌細(xì)胞的存活、增殖和遷移。

CRAF的激酶非依賴(lài)性作用首次在對(duì)Raf1敲除小鼠的研究中得到證實(shí)。CRAF在胚胎發(fā)生、血管形成和細(xì)胞存活過(guò)程中具有重要的激酶非依賴(lài)性作用。試驗(yàn)表明，CRAF在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡中具有與MAPK通路無(wú)關(guān)的功能。CRAF可以轉(zhuǎn)移到線(xiàn)粒體，在那里它磷酸化并失活促凋亡蛋白BAD。此外，CRAF可以直接結(jié)合并抑制促凋亡蛋白ASK-1和MST-2。CRAF還可以通過(guò)不同的機(jī)制調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的進(jìn)展。CRAF與腫瘤抑制因子RB相互作用并促進(jìn)E2F的釋放。CRAF還通過(guò)在G2/M轉(zhuǎn)變期間在中心體和有絲分裂紡錘極與極光激酶a和極樣激酶1（PLK1）的相互作用促進(jìn)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞和人類(lèi)結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116中的有絲分裂進(jìn)展。

RAS原癌基因家族（主要是KRAS、NRAS和HRAS）內(nèi)的激活突變發(fā)生在約30%的所有癌癥患者中，并導(dǎo)致MAPK和PI3K信號(hào)通路的組成性激活。盡管BRAF是野生型RAS下游的主要RAF亞型，但多項(xiàng)研究表明，RAS突變癌癥將這種依賴(lài)性轉(zhuǎn)變?yōu)镃RAF。此外，體外研究表明，不同的RAS亞型具有不同的激活CRAF的能力。KRASG12V比HRAS G12V106更有效地誘導(dǎo)CRAF向質(zhì)膜的募集和下游MAPK途徑的激活。CRAF結(jié)合親和力和下游ERK磷酸化在不同的RAS突變體中具有廣泛的可變性，這表明RAS突變可以通過(guò)MAPK依賴(lài)性和MAPK非依賴(lài)性的方式誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。

即使在具有野生型RAS的腫瘤中，CRAF也是腫瘤進(jìn)展所必需的。在缺乏RAS突變的人類(lèi)腎細(xì)胞癌（RCCs）中，在55%的病例中觀(guān)察到CRAF的過(guò)度磷酸化，表明CRAF在這種癌癥類(lèi)型中的主要致癌作用。類(lèi)似地，RAF1過(guò)表達(dá)還發(fā)生在50%的人肝細(xì)胞癌（HCC）中，并與CRAF活性增加有關(guān)。

CRAF的致癌改變

目前，已在癌癥患者中鑒定出腫瘤原性RAF1改變（擴(kuò)增、融合和突變）。這些改變發(fā)生的頻率低于致癌的BRAF改變，但在患者的腫瘤中越來(lái)越多地被發(fā)現(xiàn)。因此，有必要表征RAF1的各種變化，以進(jìn)一步了解致癌CRAF的生物學(xué)效應(yīng)和潛在的治療意義。

RAF1的擴(kuò)增在膀胱癌中最常見(jiàn)，在黑色素瘤、乳腺癌、胃食管癌、肉瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、卵巢癌、肝細(xì)胞癌和嗜鉻細(xì)胞瘤中也觀(guān)察到一定頻率。RAF1融合最常見(jiàn)于毛細(xì)胞星形細(xì)胞瘤亞群和0.5-1%的前列腺癌、黑色素瘤和胰腺癌。在毛細(xì)胞星形細(xì)胞瘤中，SRGAP3–RAF1融合最常見(jiàn)；在前列腺癌中，常見(jiàn)ESRP1–RAF1融合。所有的RAF1融合都失去了CRAF的N末端自身抑制結(jié)構(gòu)域，并將致癌C末端結(jié)構(gòu)域與由高表達(dá)啟動(dòng)子調(diào)控的基因偶聯(lián)，導(dǎo)致融合蛋白的過(guò)表達(dá)。

RAF1的激活突變發(fā)生頻率（~0.7%）遠(yuǎn)低于激活BRAF突變（~8%）。這種差異可能歸因于CRAF的基礎(chǔ)激酶活性低于BRAF。最常見(jiàn)的致癌RAF1突變是S257L，其次是密碼子S259和P261的突變。這三個(gè)突變體聚集在CR2中，導(dǎo)致關(guān)鍵的自身抑制位點(diǎn)S259的磷酸化顯著降低。此外，CRAF的蛋白激酶結(jié)構(gòu)域內(nèi)還有多個(gè)額外的復(fù)發(fā)致癌突變，包括R391、G361和E478。除了CR2和蛋白激酶結(jié)構(gòu)域的突變外，在人類(lèi)腫瘤中還發(fā)現(xiàn)了其他RAF1突變，如K106R和L613V。

CRAF在治療反應(yīng)中的作用

新出現(xiàn)的證據(jù)表明，CRAF代表了對(duì)許多MAPK靶向療法的治療耐藥性的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。事實(shí)上，BRAF依賴(lài)性腫瘤可以轉(zhuǎn)變?yōu)镃RAF依賴(lài)性，作為對(duì)BRAF靶向治療的抵抗機(jī)制。多個(gè)致癌RAF1突變（G361A、S257P、P261T和R391W）已被證明對(duì)BRAF V600E抑制劑vemurafenib具有耐藥性。

截短的RAF1通過(guò)與RAF1融合相同的機(jī)制，在體外顯示出在癌癥細(xì)胞中賦予對(duì)MET靶向治療和EGFR靶向治療的耐藥性。這可能是由于截短的RAF1介導(dǎo)的MAPK通路的過(guò)度激活。RAF1融合和突變也與對(duì)新型KRAS G12C抑制劑的耐藥性有關(guān)。通過(guò)多種機(jī)制維持CRAF激活是所有KRAS G12C抑制劑抗性細(xì)胞系的共同特征。KRAS G12C抑制劑已被批準(zhǔn)用于治療KRAS G12C-突變型肺癌，隨著KRAS抑制劑在臨床開(kāi)發(fā)中的進(jìn)展以及BRAF和MEK抑制劑越來(lái)越多地用于更廣泛的癌癥類(lèi)型，CRAF介導(dǎo)的對(duì)MAPK抑制劑的耐藥性將在臨床實(shí)踐中變得越來(lái)越普遍。需要進(jìn)一步的研究來(lái)測(cè)試和開(kāi)發(fā)治療策略，最大限度地減少CRAF介導(dǎo)的MAPK抑制劑耐藥性，并為新發(fā)或獲得性CRAF依賴(lài)性腫瘤開(kāi)發(fā)最佳療法。

CRAF突變腫瘤的潛在治療策略

直接抑制致癌驅(qū)動(dòng)因素的改變通常是癌基因驅(qū)動(dòng)腫瘤最有效的靶向治療策略。泛RAF抑制劑是一類(lèi)新的MAPK抑制劑，可以抑制野生型和突變型BRAF以及野生型CRAF。因此，這些泛RAF抑制劑代表了靶向RAF1改變腫瘤的有前景的新療法。

與BRAF抑制劑（如vemurafenib）不同，泛RAF抑制劑不會(huì)在BRAF野生型或RAS突變細(xì)胞中引起MAPK途徑的異常激活。此外，與前幾代激酶抑制劑如索拉非尼和瑞戈非尼相比，泛RAF抑制劑是CRAF和BRAF的更特異性抑制劑。目前，許多新型泛RAF抑制劑正處于早期臨床開(kāi)發(fā)階段，用于治療RAS或BRAF突變腫瘤。

這些泛RAF抑制劑中的大多數(shù)目前也在評(píng)估是否與其他靶向療法，如MEK、ERK、EGFR和CDK4/6抑制劑或免疫療法（抗PD1單克隆抗體）聯(lián)合使用。最近報(bào)道了泛RAF抑制劑納波拉非尼和MEK抑制劑曲美替尼聯(lián)合應(yīng)用的I期試驗(yàn)結(jié)果，該試驗(yàn)在NRAS突變黑色素瘤患者中具有良好的抗腫瘤活性。

小結(jié)

CRAF是一種蛋白激酶，它的突變和過(guò)度激活驅(qū)動(dòng)癌癥的進(jìn)展和治療耐藥性。臨床實(shí)踐中越來(lái)越多地發(fā)現(xiàn)癌癥患者中的RAF1改變，但目前，對(duì)于RAF1改變的腫瘤，還沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)的治療方法。然而，幸運(yùn)的是，有大量新的臨床前和臨床證據(jù)表明，多種新的靶向治療方法與MAPK通路抑制劑的新組合對(duì)RAF1改變的腫瘤具有療效。這些新抑制劑的可用性和有效性突出了CRAF作為癌癥治療靶點(diǎn)的潛力。

參考文獻(xiàn)：

1.  Therole of CRAF in cancer progression: from molecular mechanisms to precisiontherapies. Nat Rev Cancer. 2024 Jan 9.

       原文標(biāo)題 : CRAF在癌癥進(jìn)展中的作用：從分子機(jī)制到精準(zhǔn)治療