前言

CpG 寡聚脫氧核苷酸（CpG-ODN）是一種免疫調(diào)節(jié)合成寡核苷酸，通過特異性地刺激Toll樣受體9（TLR-9），誘導細胞免疫和體液免疫，增強機體免疫應答。機體在感染后，病原體表達的進化上保守的分子結構可以觸發(fā)先天免疫反應，這些結構被稱為病原體相關分子模式，被宿主TLRs識別。病原體相關的分子模式，如脂多糖和脂蛋白被TLR4和TLR2識別；細菌的鞭毛蛋白被TLR5識別；dsRNA被TLR3識別，而ssRNA被TLR7/8識別；存在于細菌和病毒DNA中的未甲基化CpG基序被TLR9識別。

TLR激活引發(fā)的先天免疫反應的特征是產(chǎn)生促炎細胞因子、趨化因子、I型IFN和抗菌肽。隨后，宿主產(chǎn)生適應性免疫反應，產(chǎn)生高親和力抗體，并產(chǎn)生細胞毒性T細胞，提供殺菌免疫并保持免疫記憶，以防止隨后的感染。由于CpG能夠有效地誘導先天免疫反應，并有助于適應性免疫，因此它們作為疫苗佐劑的潛在應用備受關注。

CpG的種類

根據(jù)化學結構和生物學活性，CpG-ODNs 可分為 A，B 和 C 3種類型。其中，B 型 CpG是發(fā)現(xiàn)最早、研究得最清楚的類型。它由一個或多個CpG基序組成，通常位于硫代磷酸酯骨架上。與天然磷酸二酯酶核苷酸相比，這種主鏈增強了對核酸酶消化的抵抗力，為其提供了更長的體內(nèi)半衰期（30–60分鐘，而磷酸二酯酶為5–10分鐘）。B型CpG觸發(fā)漿細胞樣樹突狀細胞（pDC）分化并產(chǎn)生TNF-α，并刺激B細胞增殖和分泌IgM。

A 型 CpG以含有CpG 二核苷酸的回文序列為核心，兩端為 poly G尾，磷酸二酯鍵骨架為部分硫代修飾。這類 CpG通過回文序列和 poly G 形成高級結構，能夠活化 pDC 誘生大量 I 型干擾素，但對B 細胞活性很弱。B型CpG與A型CpG的不同活性很大程度上是由于CpG/TLR9復合物在pDC內(nèi)體中的保留時間不同。B型CpG通過早期內(nèi)體快速轉(zhuǎn)運到晚期內(nèi)體，而A型CpG在早期內(nèi)體中保留的時間更長。A型CpG這種結構特征可導致CpG 分子在溶液中形成復雜多聚體，因此其在臨床上的研究一直進展緩慢，最近研究集中在將其包裝成穩(wěn)定的病毒樣顆粒（VLP），用作佐劑使用。

C型CpG在完全由硫代磷酸核苷酸組成方面類似于B型，但在包含回文CpG基序方面類似于A型，因此可以形成莖環(huán)結構或二聚體。它兼具 A 和 B 型 CpG的活性，既能活化pDC，又能活化 B 細胞。

不同 CpG 基序作用于不同物種引起的免疫刺激效應有所差異，具有種屬特異性，同時 CpG 的核心序列、回文結構等均對其活性有顯著影響。

CpG的基序

1995 年發(fā)表的論文中首次提出了CpG 基序的概念。CpG 基序是指以非甲基化 CpG 為核心、5' 端為 2個嘌呤、3' 端為 2 個嘧啶的六核苷酸序列，如GACGTT 和 AACGTT 等。CpG 基序中CpG 二核苷酸為活性所必需，旁側序列也與活性密切相關，不但決定活性的強弱，后來還發(fā)現(xiàn)決定活性的種屬特異性。

美國 Coley's公司在1998-2000年間發(fā)現(xiàn)了首個具有高度免疫刺激活性的人CpG基序 GTCGTT， Coley's公司根據(jù) GTCGTT 設計了 CpG-2006 (又名 CpG-7909)。同時，研究還發(fā)現(xiàn)了另一個活性相似的 人 CpG 基 序GTCGTC。與小鼠 CpG 基序不同，這兩個人源CpG 基序 5' 端第二位為嘧啶，而不是嘌呤，從而表明存在種屬特異的 CpG 基序。通過比較不同突變體對人和小鼠免疫細胞的活性，最終確定活化人免疫細胞的CpG 基序為 TCGT，而活化小鼠免疫細胞的 CpG 基序為 A/TCGTT (5' 端第一位 A 活性強于 T) 。該發(fā)現(xiàn)不但修正了以前對CpG 基序的理解，更重要的是發(fā)現(xiàn)了對人和小鼠具有交叉免疫刺激活性的 CpG 基序 TCGTT，研究人員今后可以方便地使用小鼠模型來研究CpG的潛在臨床應用價值。

CpG的種屬特異性

現(xiàn)已明確 TLR9 對CpG的識別是脊椎動物免疫系統(tǒng)識別病原微生物的一種先天性免疫應答機制。物種分化、TLR9變異和自然選擇等因素共同作用導致不同物種通過各自的TLR9 變異體識別不同微生物來源的 CpG，其中人和小鼠 TLR9 在氨基酸水平上只有76%的同源性，因此不難理解自然界存在種屬特異的 CpG 基序及其識別機制。

最早研究發(fā)現(xiàn) GACGTT 和AACGTT 等CpG 基序具有很強的小鼠特異性，但對人免疫細胞的活性較弱。即使如此，Dynavax 公司在乙肝預防性疫苗的III期臨床研究中已證明含有AACGTT的CpG-1018具有良好的疫苗佐劑活性。然而這類序列用于人體臨床的劣勢在于所需劑量較大，每劑疫苗含有3 mg CpG-1018。

后來，Coley's 公司發(fā)現(xiàn)的GTCGTT 對人和小鼠具有交叉免疫刺激活性，隨后證明該序列對羊、馬、豬、狗、兔等其他物種也有廣泛免疫刺激活性。該序列的核心為人 CpG 基序 TCGT，因此對人免疫細胞具有很強的活性。Coley's 公司根據(jù) GTCGTT 設計了 CpG-7909，在乙肝預防性疫苗的I/II期臨床研究中證明每劑 0.125~1mg 的 CpG-7909 就具有良好的疫苗佐劑活性。相對于 CpG-1018，這類序列在臨床應用中不但具有活性優(yōu)勢，還具有使用劑量低而更加經(jīng)濟安全的優(yōu)點。

此外，研究表明，CpG效應細胞也具有種屬特異性，在小鼠中為單核/巨噬細胞、樹突狀細胞和 B 細胞，在人體中為pDC和 B 細胞。CpG效應細胞的種屬特異性提示動物模型研究結果并不一定能夠在人體臨床中得到重現(xiàn)。然而臨床研究表明 CpG是一種良好的疫苗佐劑，雖然人常規(guī)樹突狀細胞不表達TLR9，但CpG激活的pDC 和B 細胞具有足夠強大的抗原提呈能力；另一方面，CpG在小鼠中可激活單核/巨噬細胞誘生大量 TNF-α，從而產(chǎn)生嚴重毒副作用，而在人體中這些細胞并不表達TLR9，因此 CpG在人體中可能具有更好的安全性。

CpG疫苗佐劑的臨床研究

自2000年以來，已有20種以上 CpG佐劑疫苗陸續(xù)進入臨床研究。這些研究涉及傳染病、腫瘤和過敏等疾病的預防性和治療性疫苗，使用的疫苗抗原主要為重組蛋白和合成多肽，使用的CpG主要為B型，如CpG-1018。

第一個完成III期試驗的含CpG的疫苗是針對乙型肝炎病毒的HEPLISAV。此前批準的HBV疫苗多是明礬佐劑疫苗，需要在6個月內(nèi)進行三次免疫接種才能達到保護性抗體滴度。然而即使接種了完整系列的此種疫苗，仍有5-10%的免疫能力個體無法實現(xiàn)持久的血清保護。HEPLISAV中加入CpG可以改善針對HBV的體液和細胞介導的免疫反應的誘導。在III期臨床試驗中，與明礬佐劑疫苗相比，HEPLISAV以更少的免疫接種引發(fā)了更高的血清保護性抗體滴度。美國食品和藥物管理局（FDA）于2017年批準其用于預防所有已知的HBV亞型引起的18歲以上成年人感染。

CpG作為佐劑的瘧疾疫苗在美國、澳大利亞和馬里進行了I期和IIa期試驗。結果顯示，CpG使志愿者對瘧疾抗原產(chǎn)生了明顯更強的免疫反應。與單獨的抗原相比，CpG與抗原的結合使平均中和抗體滴度增加了六倍。這種增強的抗體反應是持續(xù)的：在接種疫苗后236天，加CpG免疫的人群血清抗體滴度比單抗原免疫的人群仍高4.6倍。

涉及CpG的臨床試驗數(shù)量最多的是在腫瘤學領域。一種主要的方法是將CpG與腫瘤相關抗原（TAAs）或腫瘤細胞結合。例如，在黑色素瘤患者的MART-1肽疫苗中添加CpG導致抗原特異性CD8+T細胞的頻率增加10倍。在I/II期試驗中，通過在MAGE-3疫苗中添加CpG，抗MAGE-3抗體滴度得到增強，其中一名患者產(chǎn)生了持久的客觀反應。CpG也作為轉(zhuǎn)移性腎細胞癌患者的疫苗佐劑進行研究。初步結果顯示，用自體腫瘤細胞、CpG和GM-CSF接種疫苗，然后用IFN-α和CpG維持治療，在七名患者中有三名病情部分緩解或穩(wěn)定。

游離CpG誘導腫瘤特異性CTL的能力也在研究中。該概念涉及將CpG遞送給接受過細胞毒性腫瘤治療（包括放療、化療或使用單克隆抗體治療）的患者。在這種條件下，CpG促進腫瘤細胞釋放的腫瘤抗原的攝取，并改善隨后的免疫反應。對惡性膠質(zhì)瘤和淋巴瘤患者的初步研究支持TLR9激動劑可以協(xié)同增強傳統(tǒng)的抗腫瘤策略的療效。迄今為止，這種組合顯示出良好的臨床益處和安全性。

CpG的另一種給藥方法涉及腫瘤內(nèi)注射。該策略旨在激活癌癥微環(huán)境中存在的DC，從而促進原位抗原的呈遞。在進行的幾項臨床試驗中， CpG在腫瘤內(nèi)遞送以治療惡性皮膚腫瘤或淋巴瘤，這些試驗產(chǎn)生了有希望的結果。這種策略在一半的基底細胞癌或黑色素瘤患者中誘導了腫瘤的完全或部分緩解，腫瘤內(nèi)給予CpG（單獨或與放射治療聯(lián)合）通過改善淋巴瘤和黑色素瘤病人中腫瘤特異性CD8+T細胞的產(chǎn)生，誘導了全身腫瘤消退。

安全性方面，CpG 佐劑會引起輕微至中度的副反應，包括注射位點疼痛、腫脹、硬結、紅疹等局部反應以及流感樣癥狀等系統(tǒng)癥狀，幾天內(nèi)會得到緩解，可能是由其免疫刺激特性導致的。

小結

在過去20-30年中，大量動物實驗和臨床研究證明 CpG是一種具有良好應用前景的新型人用疫苗佐劑。與現(xiàn)有疫苗佐劑相比，CpG的作用機制更為明確，具有更強的疫苗佐劑活性，尤其是細胞免疫佐劑活性。此外，CpG-ODNs 可通過化學合成大規(guī)模生產(chǎn)，易于質(zhì)控，成本理想。隨著對不同來源 CpG 佐劑的安全性、有效性研究的廣泛、深入開展，研究數(shù)據(jù)的不斷積累也將提升研究者與監(jiān)管方對 CpG 的認知，CpG終將成為一種理想的新型人用疫苗佐劑。

參考文獻：

1.Recent progress concerning CpG DNA and itsuse as a vaccine adjuvant. Expert Rev Vaccines.2014 Feb; 13(2): 299–312.

2. CpG-ODNs 疫苗佐劑的研究進展

3. CpG ODN 佐劑的研究進展及其藥學研究的思考

       原文標題 : CpG疫苗佐劑的研究進展