前言

迄今為止，與傳統(tǒng)的抗癌治療策略相比，免疫治療被認為是最有前景的全身性腫瘤治療方法，其中，單克隆抗體因其特異性靶向分子的能力，已成為癌癥治療中一種關鍵而有效的治療方式。然而，由于腫瘤復雜的疾病發(fā)病機制，針對單一靶點的單克隆抗體往往不足以表現(xiàn)出足夠的治療效果。因此，針對多個靶點的雙特異性抗體（bsAbs）應運而生，它的發(fā)展改變了腫瘤免疫治療的領域。

由于能夠同時針對腫瘤細胞或腫瘤微環(huán)境（TME）中的兩個表位，bsAbs逐漸成為下一代治療性抗體的一個重要和富有前景的組成部分。目前正在開發(fā)的大多數(shù)bsAbs被設計成T細胞結合器，通過將免疫細胞，特別是細胞毒性T細胞，與腫瘤細胞緊密相連，從而形成一個人工免疫接觸，最終導致靶向腫瘤細胞的選擇性攻擊和裂解。目前，許多臨床前和臨床試驗正在進行中，腫瘤免疫治療進入了雙抗時代。

bsAb的發(fā)展史

BsAbs最初的概念是由AlfredNisonof在20世紀60年代首次提出的。他將兩個不同的抗原結合位點結合在一個分子中，并從抗牛γ球蛋白和抗卵清蛋白單價片段的混合物中獲得了一個具有雙重特異性的F（ab’）2分子。

1975年，K?hler和Milstein發(fā)明了雜交瘤技術，最終解決了生產(chǎn)單克隆抗體的問題，開啟了單克隆抗體治療的新時代。1983年，Milstein和Cuello開創(chuàng)了quadroma技術，該技術基于分泌Abs混合物的兩種不同雜交瘤細胞系的體細胞融合，包括具有雙重特異性的鼠IgG形式的bsAb。然而，bsAb的低產(chǎn)率以及難以從密切相關的錯配副產(chǎn)物中純化所需的Ab是一個重大問題。

1988年，James Huston和他的同事發(fā)明了單鏈抗體片段（scFv），它最大限度地減少了復性問題，例如不正確的結構域配對或聚集。1996年，Genentech的科學家們利用重組DNA技術發(fā)明了knob－into－h(huán)ole技術，克服了Quadrome技術的局限性。通過在人類IgG的CH3結構域之間的界面突變選定的氨基酸，可以減少IgG重鏈的錯配。這種技術利用更有利的蛋白質(zhì)相互作用，最終可以形成高達90％的正確雙特異性重鏈配對。隨后，隨著抗體工程和生物學的進展，bsAb的不同概念和結構正在不斷演變。

目前，許多bsAb已被開發(fā)為治療實體癌和血液癌的藥物。截至2021年12月，3種類型的bsAb已被美國食品和藥物管理局（FDA）批準用于診所治療癌癥。

bsAb的模式

抗體由四條多肽鏈組成，分子量較大的兩條鏈稱為重鏈（H鏈），而分子量較小的兩條鏈稱為輕鏈（L鏈）。在單抗中，兩條H鏈和兩條L鏈的氨基酸組成完全相同，而雙特異性抗體的開發(fā)是通過共表達兩條不同的H鏈和兩條不同的L鏈。從10種可能的H2L2重組混合物中獲得功能性雙特異性抗體是雙特異性抗體開發(fā)的最初挑戰(zhàn)之一，這通常稱為鏈相關問題。

在過去幾十年里，研究者們已經(jīng)開發(fā)了許多策略，以解決這一問題。由這些策略誘導的不同設計特征或功能特性可用于所產(chǎn)生的雙特異性抗體模式的分類。            

基于片段的模式（Fragment－based formats）

基于片段的雙特異性抗體簡單地將多個抗體片段結合在一個分子中，不含F(xiàn)c區(qū)域（fragment crystallizable，可結晶片段，與抗原結合片段Fab相對），避免了鏈相關問題，優(yōu)勢是產(chǎn)量高、成本低；缺點是半衰期相對較短。此外，基于片段的雙特異性抗體可能會出現(xiàn)穩(wěn)定性和聚合問題。

對稱模式（Symmetric formats）

對稱模式的雙特異性抗體保留了Fc區(qū)域，更接近于天然抗體，但在大小和結構上有所不同。這些差異可能對與天然抗體相關的有利特性（如穩(wěn)定性和溶解度）產(chǎn)生負面影響，從而可能損害這些雙特異性抗體的理化和／或藥代動力學特性。

不對稱模式（Asymmetric formats）

大多數(shù)不對稱模式的雙特異性抗體與天然抗體非常相似，被認為具有最低免疫原性的潛力。不過，解決鏈相關問題可能涉及到的復雜工程可能會抵消一些不對稱模式雙特異性抗體的這一優(yōu)勢。

bsAb的作用機制

根據(jù)其功能機制，BsAb可分為4類：結合同一抗原的兩個表位、細胞－細胞接合器、雙功能調(diào)節(jié)劑和細胞治療中的BsAb。其中，T細胞接合器是臨床研究中應用最廣泛的形式，已被證明能誘導腫瘤特異性免疫細胞激活。

結合同一抗原的兩個表位

人們已經(jīng)開發(fā)了同時針對同一靶抗原內(nèi)2個不同表位的雙副表位抗體。例如，靶向癌胚抗原（CEA）或VEGF2的bsAb被開發(fā)用于治療癌癥。人們還開發(fā)了幾種bsAb來中和病毒抗原，例如，針對HBV表面抗原和HIV－1包膜蛋白的bsAb顯示出針對同源抗原的中和活性。

細胞接合器

細胞接合器連接兩種不同類型的細胞，主要是腫瘤細胞和T／NK細胞，以誘導腫瘤細胞溶解。細胞接合器由TAA靶向部分和效應細胞識別部分組成，并進一步分為T細胞接受器和NK細胞接受器。

T細胞接合器利用TAA和TCR成分（主要是CD3），它們連接腫瘤細胞和T細胞，繞過TCR－MHC－I相互作用。因此，無論抗原特異性如何，T細胞結合器都會觸發(fā)T細胞活化，產(chǎn)生包括穿孔素和顆粒酶在內(nèi)的細胞毒性分子，以殺傷腫瘤細胞。

BiTE是T細胞結合器的一種形式，通過靶向TAA和CD3的單鏈抗體將腫瘤細胞和T細胞結合，用于T細胞介導的腫瘤細胞殺傷。靶向CD19和CD3的blinatumomab是臨床上典型的BiTE，2014年，blinatumomab成為第一個被FDA批準的BsAb，用于治療ALL患者，在隨后的幾年里，blinatumomab的治療范圍進一步拓寬，2018年，F(xiàn)DA批準其用于首次或第二次完全緩解后MRD≥0．1％的pre－B ALL患者群體的治療。目前，超過60例BiTE形式的雙抗正在進行I／II期臨床試驗。

NK細胞接合器將CD16A＋NK細胞重定向至腫瘤細胞，誘導NK細胞活化。與BiTE相比，NK細胞接受者表現(xiàn)出較少的不良反應，如細胞因子釋放綜合征（CRS）和神經(jīng)毒性。多種細胞毒性受體可激活NK細胞：CD16（FcγRIII）、天然細胞毒性受體（NCR；NKp30、NKp44、NKp46）、C型凝集素樣受體NKG2D（CD314）和CD94／NKG2C。最近，抗CD30×CD16A的NK細胞接合器（AFM13）在AACR 2022的報告中展示了不俗的抗腫瘤效果。

雙功能調(diào)制劑

雙功能調(diào)節(jié)劑同時結合兩種不同的免疫共刺激或共抑制分子，誘導靶細胞的功能改變。大多數(shù)雙功能調(diào)節(jié)劑靶向PD－1／PD－L1軸和其他免疫抑制分子，如CTLA－4（CD152）、TIM－3、LAG－3或TIGIT。MEDI5752（PD－1×CTLA－4）抑制PD－1＋激活的T細胞中CTLA－4的功能，誘導PD－1的快速內(nèi)化和降解。與PD－1和CTLA－4單抗聯(lián)合治療相比，MEDI5752的活性顯著增強。針對其他檢查點分子的雙功能性抑制劑，包括LAG－3和TIGIT，也正在開發(fā)中。

過繼細胞治療中的bsAbs

盡管CAR－T細胞療法在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中顯示出療效，但也觀察到了副作用，包括CRS、神經(jīng)毒性和靶向非腫瘤效應。為了將不良反應降至最低，正在進行用BsAbs體外激發(fā)T細胞的研究。與單獨的BsAb和T細胞輸注相比，在體外BsAb武裝的T細胞治療可誘導強烈的抗腫瘤反應，有效滲透到腫瘤部位，并減少細胞因子的釋放，從而將系統(tǒng)不良反應降至最低。

OKT3×hu3F8 BsAb武裝T細胞（GD2BATs）在體外誘導特異性殺傷GD2陽性神經(jīng)母細胞瘤和骨肉瘤細胞系。在GD2陽性腫瘤患者的I期試驗中，GD2BATs在一些患者中顯示出臨床反應，且無明顯副作用。

BiTE與CAR－T

BiTE和CAR－T細胞療法之間有明顯的相似性。和BiTEs一樣，CAR－T細胞能夠通過可變的TAA靶向抗原結合域（通常是單鏈抗體）識別腫瘤細胞。然而，與BiTEs激活不同的是，T細胞不是通過內(nèi)源性TCR復合物激活的，而是通過來自CD3和共刺激分子（如4－1BB和CD28）的細胞內(nèi)信號轉導域激活的，這些區(qū)域被整合到一個合成的細胞表面受體中，細胞外部分含有單鏈抗體（即CAR）。因此，用CAR結構轉導患者的T細胞會導致這些效應細胞針對選定的靶TAA重新定向，從而發(fā)揮對腫瘤細胞的殺傷。與BiTE的生產(chǎn)不同，CAR－T細胞制造需要體外基因修飾和細胞擴增，特別是自體T細胞，這是一個相對低效、資源密集、耗時且成本高昂的過程。

T細胞與靶細胞之間免疫突觸的形成，細胞的連續(xù)殺傷能力，以及細胞溶解蛋白如穿孔素和顆粒酶的定向釋放，是CAR－T細胞和BiTEs共同的作用模式特征。此外，BiTEs和CAR－T細胞都是通過CD8＋T細胞和CD4＋T細胞發(fā)揮其效應功能。然而，體外和體內(nèi)研究表明，來自低分化和未接觸抗原的T細胞亞群，如干細胞記憶T細胞（Tscm）或中心記憶T細胞（Tcm）的CAR－T細胞具有優(yōu)越的抗腫瘤活性、增強的擴增能力和持久的存活期，而BiTE介導靶細胞死亡主要通過抗原經(jīng)歷的T細胞在激活后分化為效應記憶T（Tem）細胞。

下一代的T細胞結合器

CiTE

雙功能檢查點抑制性T細胞接合器（CiTEs）將局部限制性免疫檢查點抑制功能與BiTEs的T細胞重定向功能結合在一個分子中。CiTEs將PD－1／PD－L1的抑制性功能局限在靶向TAA相互作用的重定向T細胞局部，因此，該分子BiTE部分的功效得到增強，同時避免了與抗PD－1或抗PD－L1 ICI相關的T細胞的全身活化，從而限制了與免疫有關的不良事件的風險。

這種新型T細胞接合器的概念證明已在AML的臨床前模型中得到驗證。基于類似的機制，Horn等人已經(jīng)開發(fā)出一種抗PD－L1–CD3的BiTE，它同時將內(nèi)源性T細胞和NKT細胞重新定位到PD－L1＋細胞。臨床前研究表明，當與其他不能中和PD－1／PD－L1介導的免疫抑制的免疫療法聯(lián)合使用時，這種形式的CiTE可能對PD－L1表達的實體瘤患者有效。

SMITE

同時多重相互作用BiTE（SMITEs）是另一種創(chuàng)新的T細胞參與治療形式。SMITEs由兩個單獨的BiTE組成，每一個都針對不同的抗原，其中一個以CD3為靶點，在與靶TAA結合時誘導TCR信號，而另一個靶向CD28以提供T細胞共刺激信號。例如，含有抗PD－L1–CD28 BiTE的SMITEs可通過CD28與T細胞的結合將抑制性PD－L1信號轉化為正向的共刺激信號，這些T細胞通過第二個TAA特異性和CD3靶向的BiTE進一步潛在地共同激活。SMITEs可以在任何一種BiTE的最低活性濃度甚至更低的濃度下，依然發(fā)揮有效作用。SMITE平臺不僅提供了克服由免疫檢查點蛋白介導的抵抗機制的機會，而且還可以靶向更廣泛的細胞表面TAA，以提高腫瘤的特異性，同時限制免疫逃逸的風險。

TriKE

增強效應細胞細胞毒性的另外一種形式是三特異性殺傷接合器（TriKEs），其主要目的是利用NK細胞對抗癌細胞的活性，并包含與免疫刺激細胞因子相連的雙特異性抗體。一種抗CD33－CD16／IL－15的TriKE能將NK細胞定向到髓系母細胞，目前正在AML患者中進行臨床研究（NCT03214666）。

DART

改變“典型”BiTE的結構可以提供多種新的治療方法。例如，新的雙親和力再靶向蛋白（DART）已經(jīng)被開發(fā)出來，它們具有比BiTEs更有利的結構和生物學特性，包括更大的穩(wěn)定性和將T細胞毒性靶向惡性細胞的最佳重定向。DART分子是由提供雙重抗原結合位點的兩個Fv鏈組成的雙特異性diabody，通過二硫鍵和非共價鍵組裝，從而提高穩(wěn)定性并限制鏈內(nèi)域相互作用

DARTs的結構使目標和效應細胞之間的最佳交互作用成為可能，從而產(chǎn)生高水平的靶細胞殺傷。在臨床前模型相比，DARTs比BiTEs表現(xiàn)出更好的細胞毒性。在臨床前模型中，DART分子已成功應用于NK細胞或T細胞對惡性B細胞的再靶向（抗CD16–CD32B DART或抗CD19–CD3 DART duvortuxizumab，也稱為MGD011）和T細胞向CD123＋AML細胞的再靶向（flotetuzumab；MGD006）或糖蛋白A33表達的胃腸道癌細胞（gpA33；MGD007）；這些藥物大多已進入臨床開發(fā)階段（NCT02454270、NCT02152956、NCT03739606、NCT02248805和NCT03531632）。

重要的是，DART分子可被設計成包含F(xiàn)c結構域（例如，duvortuxizumab、gpA33和PRS－343），其半衰期更長，因此有助于使用更方便的間歇給藥，而不是連續(xù)輸注。

CrossMAb

傳統(tǒng)的BiTEs是對稱設計的，CD3和TAA為1：1，通過1：2設計增加結合能力可能提高對腫瘤細胞的識別，同時避免在TAA缺失的情況下CD3在T細胞上的激活。一種被稱為CrossMAb技術的創(chuàng)新設計平臺能夠以完整的IgG形式生成1：2價的雙特異性抗體。Cibisatamab（又稱CEA－TCB）是一種CrossMAb 形式的雙抗，CD3和CEA的效價為1：2。Cibisatamab于2014年進入I期試驗，目前正在表達CEA的實體瘤患者中進行研究（NCT02324257和NCT02650713）。

第一階段的結果顯示了很好的療效并誘導出高度炎癥性的TME。同時，至少有8種基于IgG的雙特異性抗體已經(jīng)使用CrossMAb技術進行開發(fā)，目前正在進行臨床研究或處于臨床前開發(fā)后期。其中抗CD20–CD3的REGN1979對NHL患者有良好的療效。

ImmTACs

抗癌免疫動員單克隆T細胞受體（ImmTACs）是一種新型的雙功能抗體藥物，結合了基于TCR的靶向系統(tǒng)和抗CD3單鏈抗體效應器功能。因此，這些分子可以將多克隆效應性T細胞重定向到肽－MHC復合物中呈現(xiàn)的TAAs或腫瘤特異性新抗原，包括來自細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的抗原。通過利用可溶性高親和力單克隆TCR結構域促進大量多克隆效應T細胞的招募，這類分子有潛力以現(xiàn)成的形式克服非炎性環(huán)境的TME。

Tebentafusp是第一個ImmTAC，靶向黑色素瘤相關抗原gp100與HLA－a＊02：01復合物呈遞的多肽；這種藥物已經(jīng)在晚期葡萄膜黑色素瘤患者中顯示出臨床活性，并于2016年被FDA授予孤兒藥資格，并于2019年獲得快速通道資格。

小結

在過去的30年里，人們目睹了一個巨大的轉變，從僅僅開發(fā)和改造基本的Abs，發(fā)展到更復雜的Ab衍生物，其形狀和尺寸多種多樣，尤其是bsAb。bsAb技術在臨床應用中具有非凡的前景，吸引了研究人員的注意并已發(fā)展出極為豐富的形式，為基于BSAB的癌癥免疫治療奠定了堅實的基礎。

目前臨床試驗中的大多數(shù)bsAb（67％）旨在對抗血液惡性腫瘤。相比之下，靶向?qū)嶓w腫瘤的bsAb值得進一步研究，因為其對正常組織或其他復雜因素（包括免疫耐受性癌間質(zhì)、新生血管紊亂，bsAb藥物的滲透不足）有不可避免的不良影響。因此，人們對正在進行的實體腫瘤中的bsAb研究充滿熱情，這些研究有望在不久的將來產(chǎn)生有希望的結果。總之，bsAb研究的結果證明了這些分子在新的藥物設計和隨后的癌癥治療臨床應用中具有良好的前景。

參考文獻：

1．Development of Bispecific Antibody for CancerImmunotherapy： Focus on T Cell Engaging Antibody． Immune Netw． 2022 Feb； 22（1）： e4．

2． T cell－engaging therapies － BiTEs and beyond． Nat Rev Clin Oncol． 2020 Jul；17（7）：418－434．

       原文標題 : 雙特異性抗體之T細胞結合器