TCR－T細胞療法的工作流程

為了分離治療性TCR，必須首先從患者或健康獻血者的血液中分離抗原特異性T細胞，并在體外用特異性肽抗原以及細胞因子（如IL－2和IL－15）進行擴增。這一過程需要事先確定可安全靶向于患者的特定腫瘤相關肽靶點。在選擇了靶抗原后，可以使用不同的方法來篩選具有所需的高親和力和腫瘤特異性的TCR。臨床前安全性測試對于確保分離的高親和力TCR的最小靶外效應和交叉反應性也是必要的。病毒載體通常用于對自體患者T細胞進行基因修飾，以表達經驗證的治療性TCR，然后再輸回患者體內。

確定靶抗原

T細胞識別的黑色素瘤抗原1（MART－1）是TCR－T臨床試驗中第一個靶向的腫瘤相關抗原。在這一突破之后，針對多種腫瘤抗原的TCR－T療法已經開發(fā)出來，包括針對MAGE－A3、MAGE－A4、GD2、間皮素、gp100、MART1、AFP、CEA、NY－ESO－1以及源自HPV和EBV的病毒肽的TCR－T療法。其中，NY－ESO－1已被證明是TCR－T細胞最有希望的靶點之一，在治療滑膜肉瘤方面取得了成功，客觀有效率為67％。

理想的TCR－T靶抗原顯示以下特征：（1）誘導免疫反應的能力；（2）與驅動腫瘤表型（如癌基因）相關，以降低抗原丟失和腫瘤免疫逃避的風險；以及（3）在腫瘤干細胞上的表達以促進永久性腫瘤根除。

腫瘤相關抗原的鑒定方法

高分辨率質譜（MS）已被證明是促進從腫瘤細胞直接識別HLA－I結合肽的最強大的高通量方法。在這種方法中，通過免疫沉淀（IP）從腫瘤組織或細胞系中分離HLA－I／肽復合物，然后充分洗滌并應用酸性洗脫緩沖液，從HLA－I分子和用于IP的抗體中分離結合肽抗原。該策略允許每個腫瘤樣本識別數千個經驗證的肽靶點，并已用于識別膠質母細胞瘤（GB）、黑色素瘤、腎細胞癌（RCC）和結直腸癌（CRC）等的HLA－I配體。

腫瘤新抗原的鑒定方法

盡管基于MS的技術可用于識別新抗原，但由于其相對較低的豐度以及MS的有限靈敏度，尤其是對于大小有限的腫瘤樣本，它們更難識別。然而，新一代測序技術的發(fā)展有助于識別和定位這類腫瘤靶點。全外顯子組DNA測序，結合計算預測算法，允許識別癌細胞中的特定遺傳改變，這些改變可以產生突變肽，并能夠呈現在腫瘤HLA－I分子上。

所有體細胞突變基因都可以進行電腦分析，以預測可能與患者個體HLA－I分子結合的潛在高親和力表位，從而被T細胞識別。隨著大型MS洗脫肽數據庫的使用，HLA－I肽結合預測算法不斷更新和改進，其他預測算法試圖考慮與細胞內過程復雜性相關的生物變量。

另一個經常使用的方法是腫瘤RNA測序，它允許選擇具有最高轉錄表達的新抗原。值得注意的是，盡管這些預測方法在識別呈遞的和高免疫原性新抗原時通常表現出非常好的準確性，但它們通常預測的新抗原靶點的數量比真實靶點的實際數量高1到2個數量級。

通過trogocytosis發(fā)現新抗原是近年來出現的一種新方法。Trogocytosis是細胞結合過程中發(fā)生的一種生物學現象，在此過程中，細胞共享并轉移膜和膜相關蛋白。Li等人發(fā)現T細胞膜蛋白特異性轉移到腫瘤靶細胞，這些靶細胞呈遞同源HLA－I／肽復合物。利用這些T細胞－靶細胞相互作用，他們通過將表達標記孤兒TCR的T細胞與同源靶細胞共同孵育，創(chuàng)建了新抗原發(fā)現系統(tǒng)。通過將熒光標記從T細胞轉移到靶細胞，該方法能夠分離這些靶細胞并對同源TCR配體進行測序，從而建立新抗原文庫。

分離腫瘤特異性T細胞和TCR

使用HLA－I多聚體、單細胞TCR測序或抗原陰性的人源化小鼠，腫瘤反應性T細胞和TCR可從自體、異體或異種細胞庫中識別鑒定。

利用HLA－I多聚體法，可通過多聚體染色和流式細胞術分選直接分離抗原特異性CD8＋T細胞。在分離成對的全長TCR序列之前，對這些多克隆T細胞進行同源肽識別和抗腫瘤功能測試。采用高靈敏度的基于PCR的單細胞TCR分析方法（TCR－SCAN），可以得到具有高親和力和特異性的TCR。

另外一種方法利用了人源化小鼠TCR基因庫，該基因庫不會發(fā)生在人類中產生的T細胞克隆缺失或耐受。為此，Li等人利用整個人類TCRα／β基因位點和嵌合HLA－A2轉基因構建了轉基因小鼠，以實現針對人類TAA的人類TCR的分離。

單細胞測序方法代表了高通量分離腫瘤特異性TCR編碼基因的更有前景的方法。使用靶向TCRα和TCRβ基因座內每個單獨V和J元件的RNA誘餌文庫，可以從剪切的基因組DNA（gDNA）片段中選擇性分離TCR編碼基因組元件，用于隨后的配對末端深度測序。這使得從人類材料或TCR人源化小鼠的寡克隆T細胞群中鑒定抗原特異性TCR成為可能。

幼稚T細胞也可以作為TCR－T治療的TCR來源。TAA和新抗原特異性T細胞可從癌癥患者外周血中的低頻前體中衍生和擴增，并可重新輸注或用作抗原特異性TCR的來源。由于癌癥患者通常表現出免疫抑制或顯性T細胞耐受，HLA－I匹配的健康供體的原始序列也代表了一個可靠的來源，因為它具有巨大的多樣性TCR序列，理論上T細胞具有任何抗原特異性，包括腫瘤新抗原。已經開發(fā)了高通量技術平臺，用于尋找原始的序列，以便快速有效地識別用于個性化過繼性T細胞治療的罕見但有治療價值的TCR。

TCR的克隆

大多數基于TCR的基因治療方法依賴于用病毒載體對T細胞進行體外轉導，最早用于基因治療的載體是腺病毒。然而，由于它們不能將轉基因整合到宿主基因組中，TCR表達在T細胞增殖過程中會丟失。此外，腺病毒的免疫遺傳特性也限制了其作為基因治療載體的應用。相比之下，逆轉錄病毒作為基因轉移載體表現出更大的前景，因為它們可以感染多種細胞，并有能力將轉基因插入宿主基因組，從而使異位TCRα／β鏈穩(wěn)定表達。

由γ－逆轉錄病毒如小鼠白血病病毒（MLV）衍生的逆轉錄病毒載體已被廣泛用于基因轉移到人類T細胞中。這種方法已被用于傳遞各種基因，包括自殺基因、TCR和CARs。主要缺點是它們不能轉導非增殖性靶細胞，這就排除了靜止的T細胞在TCR－T治療中的應用。此外，逆轉錄病毒插入突變可能引起潛在的副作用。

最近，慢病毒載體（LV）作為基因轉移載體獲得了更多的關注，因為它們可以將基因傳遞到分裂和非分裂細胞中。各種技術，如Golden Gate克隆和LR克隆，通常用于構建插入TCRα／β基因的載體。

腺相關病毒（AAV）是另一種廣泛使用的病毒載體。與腺病毒載體相比，AAV具有較低的免疫原性和更廣泛的細胞向性，因此在腫瘤基因治療中得到了廣泛的應用。為了促進轉基因整合，人們開發(fā)了自互補AAV載體（scAAV），使AAV獨立于宿主細胞的互補鏈合成，scAAV在臨床前模型中的療效優(yōu)于傳統(tǒng)AAV。

同時，一些非病毒基因編輯方法也被開發(fā)出來。mRNA電穿孔已被證明可實現短暫的TCR和CAR表達，從而將病毒成分持續(xù)存在的風險降至最低。臨床數據表明，mRNA修飾的TCR－T和CAR T細胞都是可行和安全的，沒有明顯的證據表明對正常組織有非靶向毒性。然而，缺乏持續(xù)的TCR表達可能會限制療效，需要反復輸注。此外，非病毒性睡美人反轉錄轉座子系統(tǒng)也被用于TCR和CARs的轉導。

基因編輯通過同源定向修復（HDR）可以將大基因片段特異、高效地插入靶細胞。使用CRISPR／CAS9開發(fā)的TCR－T細胞已被證明在體外特異性識別腫瘤抗原，并在體內誘導產生性抗腫瘤反應。

TCR的驗證方法

在TCR克隆后，需要進行廣泛的臨床前驗證，以證明工程化TCR－T細胞的特異性和安全性。驗證包括通過滴定同源肽抗原來評估TCR的親和力，以及測量一組對HLA－I匹配的腫瘤細胞系的殺傷作用。如果沒有這樣的腫瘤細胞系存在，靶細胞可以轉導表達相關抗原和相關的HLA－I分子。新抗原也可以在自體抗原呈遞細胞中表達，以評估TCR的抗原反應性。

安全性測試包括測試候選TCR－T對HLA－I匹配原發(fā)組織的識別能力，以確保沒有正常組織作為靶點，產生可能導致的非靶向毒性。在至少兩次TCR－T細胞治療臨床試驗中，發(fā)生過對正常腦細胞和心臟細胞的交叉反應，從而導致患者死亡。這些試驗結果強調了TCR進入臨床試驗前進行廣泛安全性試驗的重要性。

TCR－T的安全性

TCR－T細胞的ACT顯示出很高的腫瘤殺傷，但在一些臨床研究中也出現了一些嚴重的不良事件。優(yōu)化工程化T細胞中的TCR親和力至關重要，受體親和力能夠決定T細胞治療的安全性和有效性。就療效而言，親和力TCR相互作用足以激活T細胞，但需要強親和力來維持T細胞的擴增。

在I／II期ACT臨床試驗中，低親和力工程化T細胞顯示出更安全的特性，但它們的抗腫瘤反應較弱。通過識別T細胞的TCR－pMHC相互作用，可以將工程化T細胞分為高親和力型和低親和力型。此外，人們也開發(fā)了一些技術來提高TCR－T的安全性。

基于工程化T細胞的安全開關機制是一種有吸引力的策略。來源于單純皰疹病毒Ⅰ型（HSV－TK）的胸苷激酶基因是最常見的自殺基因之一。

盡管HSV－TK在基于細胞的免疫治療中顯示出安全性，但需要導入磷酸化的核苷類似物。另一個更安全的誘導T細胞安全開關稱為誘導型caspase－9（iC9）。iC9是一種修飾的人FK結合蛋白，可通過小分子化合物AP1903激活，這一過程依賴于線粒體凋亡途徑。

iC9自殺基因的免疫原性較低，引發(fā)針對轉基因細胞的免疫反應降低。基于iC9的安全開關已經被證明比先前的自殺基因更有潛力用于細胞治療。

TCR－T細胞治療的臨床現狀

截止2021年8月9日，在ClinicalTrials上共有175項使用TCR－T療法的研究正在進行中，其中71項是針對特定TAA或新抗原的特異性TCR，有32項研究已經完成。NY－ESO－1是最常見的靶向抗原，在多種癌癥中均有表達，包括骨髓瘤、黑色素瘤等。其他腫瘤睪丸相關抗原，如PRAME和MAGE蛋白，以及黑色素瘤分化抗原MART－1和gp100，以及最近的癌癥驅動因子，如WT1、KRAS和TP53，也是流行的TCR－T靶點。                    

共有83名贊助者／合作者發(fā)起或參與TCR－T細胞治療的研究，包括美國國家衛(wèi)生研究院（NIH）、政府組織、行業(yè)和大學／學術機構。目前，美國國家癌癥研究所（NCI）共支持了53個TCR－T項目，占到了所有正在進行項目的20％。

在開發(fā)TCR－T療法的29家制藥公司中，葛蘭素史克和Adaptimunime發(fā)起了最多的臨床試驗，分別為11項和7項。最近，報道了一項針對人乳頭瘤病毒（HPV）－16 E7蛋白的TCR－T細胞治療轉移性人乳頭瘤病毒相關上皮癌的1期臨床試驗（NCT02858310）。在這項研究中，12名接受治療的患者中有6名出現了客觀的臨床反應，觀察到了穩(wěn)健的腫瘤消退。這是TCR－T細胞療法的一個里程碑式的臨床試驗，證明靶向病毒抗原對病毒相關癌癥患者具有良好的臨床效果。其他被探索為TCR靶點的病毒抗原包括HPV－E6蛋白、來自EB病毒（EBV）的抗原和人類內源性逆轉錄病毒（HERV）靶點，如HERV－E。

靶向TAAs 的MART－1和NY－ESO－1 TCR－T療法在晚期黑色素瘤、骨髓瘤和非小細胞肺癌中也顯示出臨床療效。完成的TCR－T臨床試驗的總有效率（ORR）在0～60％之間。值得注意的是，這些TCR－T臨床試驗中的大多數都只入組了少量患者（2至25名），因此ORR在統(tǒng)計上可能不太準確。因此，需要更大規(guī)模的II期和III期臨床試驗來確認這些TCR－T療法的實際臨床療效。